北京時間2022年4月6日，《自然》雜志在線刊登了肖百龍與李雪明團隊合作完成的題為“PIEZO1在脂膜中的結構形變與曲率感知”的論文。
該研究首次解析了機械力受體PIEZO1在脂膜環境中的受力形變過程，定量了其皮牛尺度的機械敏感性，建立了其曲率感知理論學說，從根本上解答了其將物理機械刺激轉化成生物電信號這一核心科學問題。
PIEZO諾獎研究的未解之謎：如何感受機械力？
機械力感知決定我們的日常行為，例如握手、擁抱、親吻、行走、刷手機、血壓飆升等。力是無形的，那我們人體如何感知？直到2010年，Ardem Patapoutian教授團隊報道了一類介導人體機械力感知的分子受體—PIEZO蛋白，為我們認識了解這一基本的生物學問題帶來了突破。因為發現PIEZO并證明其觸覺受體的功能，Ardem Patapition與David Julius教授(溫度受體發現者)分享了2021年諾貝爾生理學或醫學獎（圖1）。
圖1?2021諾貝爾生理學或醫學委員會發布的示意圖總結了PIEZO的發現（上半部分）、所介導的觸覺、本體覺感知等生理病理功能（下半部分右側）、以及結構模型與機械力感知假說猜想（下半部分左側）
那么PIEZO蛋白又是如何將物理機械刺激轉化成生物電信號的呢？肖百龍及其團隊近10年致力于解答這一核心科學問題。其于2012年在Patapoutian課題組從事博士后研究期間首次證實了PIEZO蛋白是在哺乳動物中鑒定發現的首類機械門控陽離子通道（Nature 2012）；隨后其課題組與合作者在PIEZO的結構功能機制研究方面取得了一系列重要研究進展，幫助推動了PIEZO的發現與研究成為了2021年的諾貝爾生理學或醫學獎研究成果（圖2）。
圖2?PIEZO的機械力感知分子機制研究進展總結基于肖百龍與李雪明課題組合作解析的PIEZO家族成員PIEZO1(1)與PIEZO2(2)的三維結構[MacKinnon(3)以及Patapoutian & Ward(4)課題組也同時報導了PIEZO1的結構]以及機制研究(5, 6)，研究者們提出了PIEZO的機械力感知機制猜想：PIEZO形成三聚體三葉螺旋槳狀離子通道，中心是負責離子通透的孔道部分，外周是三個負責機械力感知的槳葉部分（圖1及圖3左側）。非常有趣的是，在孔道處于關閉態，嵌在細胞膜中的槳葉呈現往細胞外高度彎曲的狀態，提示其可以彎曲其所在的細胞膜，形成我們稱之為納米碗（nanobowl）狀的PIEZO-脂膜體系（圖1及圖3右側）。有研究顯示PIEZO1蛋白可以在受力刺激下發生可逆的形變(7)。基于這些結構功能研究，研究者們提出當細胞膜張力改變時，PIEZO可以從彎曲狀變為平展狀，帶動中間的孔道開放，從而將機械力刺激轉化為陽離子流通。
圖3?PIEZO通道的三聚體三葉螺旋槳狀（左側部分，俯視圖）與納米碗狀（右側部分，平視圖）三維結構但事實上，在2021年諾獎頒布時，研究者們還未能解析出PIEZO受力開放的結構。膜上PIEZO在受力后是否會如諾獎示意圖中所展示的一樣（圖1），從彎曲的關閉態進入平展的開放態？這是PIEZO諾獎研究的未解之謎。
挑戰與突破：如何引入力？
得益于冷凍電鏡在生物大分子結構解析方面的技術突破，研究者們可以解析出蛋白在靜息、游離狀態下的結構。但是，生物大分子并不是靠“呆若木雞”的狀態來發揮功能，其千姿百態的變化才是生命奧妙所在，而這些變化往往取決于其組裝形式、配體結合和所處的物理狀態（膜環境、電勢能、溫度和力等）。如何在嚴苛的冷凍樣品狀態下，引入無形的膜張力來獲取PIEZO的不同結構功能狀態呢？
肖百龍與李雪明指導四位博士生楊旭中、林超、陳旭東、李首卿對這一極具挑戰的科學問題開展研究，借鑒前人把膜蛋白重組進脂質體中，并用冷凍電鏡解析其結構的技術(8, 9)，經過反復嘗試、摸索，最終首次建立了膜上受力結構解析體系(圖4)。該策略的核心是通過蛋白與脂質體之間的曲率差異（curvature mismatch）來引入膜張力，這對PIEZO蛋白尤為適用，因為PIEZO的114個跨膜結構域形成的跨膜區并不在一個平面上，而是形成納米碗狀的凹陷結構(圖3)。
圖4?PIEZO1-脂質體冷凍電鏡三維結構解析PIEZO1的形變與曲率感知特性
PIEZO1本身的曲率半徑接近10 nm，其主要以outside-in的方式重組到脂質體中。在同等大小的脂質體中時，曲率相符呈圓形。當它重組進更大的脂質體中時，曲率半徑的差異在兩者間產生力，蛋白和膜發生形變，呈水滴狀（圖4c）。
而當一小部分PIEZO1以outside-out的方式重組到脂質體中（圖4b箭頭所示），PIEZO1蛋白與脂質體的曲率半徑朝向截然相反，膜與蛋白間產生的的作用力變大，導致PIEZO1蛋白處于受力展平的構象狀態（圖4d）。
研究者們最終得到PIEZO1在膜上契合狀態（10 nm曲率半徑）和受力展平的兩種結構，分別命名為彎曲（Curved）和平展（Flattened）構象，佐證了PIEZO1蛋白具備可逆形變和感知脂膜曲率變化的特殊能力（圖5）。
圖5?PIEZO1的彎曲（左側）和平展狀（右側）三維結構視頻：Piezo在膜上契合結構
視頻：Piezo在膜上受力展平結構
PIEZO1的機械力感知分子機制
通過比較PIEZO1在脂膜上彎曲和平展的兩種結構，研究者們對PIEZO1感受膜張力后的動態構象變化、形變參數進行了定量分析，不僅驗證了之前所提出的作用機制假說，并定量了PIEZO1的皮牛尺度的機械敏感性，進而建立了其曲率感知理論學說(圖6)。
圖6?PIEZO1-liposome從彎曲狀到平展狀的形變參數測量以及機械敏感性計算1. PIEZO1的受力形變：Piezo1在受力展平過程中，其末端有10 nm的向下位移、所占膜面積擴張了300 nm2（圖6a, b）。
2. 力的感知機制—曲率形變特性：Scheuring與Mackinnon團隊合作通過原子力顯微鏡測得PIEZO1下壓距離和所需力之間存在線性彈性關系y=7x+22(7)。引用該公式與自由能變化公式（圖6c），10 nm的位移可得出PIEZO1彎曲和平展狀態之間存在570 pN.nm的能量壘。而Nanobowl儲存了高達300 nm2的膜面積，意味著只需1.9 pN/nm的張力就能實現570 pN.nm做功，這與電生理測量值1.4 pN/nm接近(10)。
3. 力的傳導機制—納米杠桿原理：力從外周傳遞到中央孔道區。在展平過程中，胞內Beam長桿在接近中心孔道模塊區形成kink，符合之前提出的該位點承擔支點的功能推測（圖7）。基于省力杠桿原理，Beam不僅具有力的傳遞與放大功能，且具有形變緩沖作用，使長臂末端3 nm的形變縮小到短臂端1 nm的形變，使其既能控制中央孔道區的門控，又不導致其過度的擴張，從而維持PIEZO通道的陽離子選擇性通透能力。
圖7?PIEZO1的納米杠桿傳遞機制4. 力的門控機制—帽子運動，跨膜疏水門打開：PIEZO1受力展平時，使得胞外帽子與槳葉之間的相互作用被打破，帽子發生順時針旋轉，下方的跨膜孔道區發生擴張。與PIEZO2（灰色）緊閉的跨膜區疏水門相比，PIEZO1展平狀態的結構呈現10埃的擴張（圖8）。?
圖8?PIEZO1的帽子-跨膜疏水門孔機制綜上，研究者們總結出PIEZO通道的受力形變與門控機制（圖9）。
1. 在靜息狀態時，PIEZO1使脂膜發生彎曲，形成碗表面積為628nm2、投影面積為314nm2的納米碗系統，PIEZO1與脂膜處于平衡。
2. 膜張力改變時，平衡被打破，膜帶動著PIEZO1蛋白一起展平。
3. 展平的槳葉帶動胞內側的Beam發生杠桿運動，把形變傳遞到孔道區胞內側，可能通過門閂-拴鎖機制，打開三個側向出口閘門（Lateral plug gate），讓離子流入細胞 。
4. 展平的槳葉使其與帽子之間的相互作用被打破，帽子的旋轉運動，加上槳葉的展平運動，共同使得孔道區上半段的疏水閥門打開，離子則由帽子下的空隙，側向進入孔道。
圖9?PIEZO1的受力形變與門控機制模式圖視頻：Piezo彎曲和受力展平的結構比較
總結而言，本研究首次實現了對機械力受體PIEZO1通道在脂膜上受力狀態下的動態結構解析，揭示了其受力形變與脂膜曲率感知的特性，定量了其皮牛尺度的機械敏感性，建立了其曲率感知理論學說，從根本上解答了其將物理機械刺激轉化成生物電信號這一PIEZO諾獎研究的未解之謎。無形的力在物理上可被定義為受力對象的形變。而PIEZO正是利用其納米尺度的曲率形變去探測皮牛尺度的力，從而成為一類低能耗的超敏機械力感受器，不由讓研究者們驚嘆生命過程與物理原理的交匯之美！
肖百龍教授、李雪明研究員為本論文的共同通訊作者，博士研究生楊旭中、林超、陳旭東、李首卿為共同第一作者。
該研究得到了國家科技部“2030科技創新-腦計劃與類腦計劃”重大研究項目、國家自然科學基金委杰青項目以及重點項目、清華－北大生命科學聯合中心、膜生物學國家重點實驗室、高精尖結構生物學中心、生物結構前沿研究中心的項目經費支持。
感謝清華大學冷凍電鏡平臺和蛋白質制備與鑒定平臺；王宏偉教授團隊劉楠、徐潔提供石墨烯載網；閆創業研究員團隊分享deep-2D腳本；張馨予、趙天放開發EPicker軟件；以及王莉、周珩、姚霞、范瀟、雷建林、李曉敏博士給予技術上的幫助。
肖百龍博士，清華大學藥學院長聘教授，博士生導師。近年來致力于探究哺乳動物包括人類自身如何感知機械力這一生命科學本質問題，合作確立了PIEZO是哺乳動物中發現的首類機械門控陽離子通道，進而聚焦解答PIEZO通道如何將機械力刺激轉化為電化學信號這一關鍵科學問題，并致力于開發相關的新型藥物和生物技術，迄今取得了系列重要研究成果。
肖百龍實驗室長期招聘對機械力感知的分子與神經機制研究以及藥物發現感興趣的博士后與科研人員，有意向者請郵件聯系：xbailong@mail.tsinghua.edu.cn。
李雪明博士，清華大學生命科學學院長聘副教授。2009年在中科院物理研究所凝聚態物理專業取得博士學位后，赴美國加州大學舊金山分校從事冷凍電子顯微學和結構生物學的博士后研究。李雪明長期從事冷凍電子顯微學方法和技術的研究，以及相關的生物學應用研究。
相關論文信息：
https://www.nature.com/articles/s41586-022-04574-8
參考文獻
1.Zhao QC, Zhou H, Chi SP, Wang YF, Wang JH, Geng J, et al. Structure and mechanogating mechanism of the Piezol channel. Nature. 2018;554(7693):487-+.
2.Wang L, Zhou H, Zhang MM, Liu WH, Deng T, Zhao QC, et al. Structure and mechanogating of the mammalian tactile channel PIEZO2. Nature. 2019;573(7773):225-+.
3.Guo YSR, MacKinnon R. Structure-based membrane dome mechanism for Piezo mechanosensitivity. Elife. 2017;6.
4.Saotome K, Murthy SE, Kefauver JM, Whitwam T, Patapoutian A, Ward AB. Structure of the mechanically activated ion channel Piezol. Nature. 2018;554(7693):481-+.
5.Zhao QC, Wu K, Geng J, Chi SP, Wang YF, Zhi P, et al. Ion Permeation and Mechanotransduction Mechanisms of Mechanosensitive Piezo Channels. Neuron. 2016;89(6):1248-63.
6.Geng J, Liu WH, Zhou H, Zhang TX, Wang L, Zhang MM, et al. A Plug-and-Latch Mechanism for Gating the Mechanosensitive Piezo Channel. Neuron. 2020;106(3):438-+.
7.Lin YC, Guo YR, Miyagi A, Levring J, MacKinnon R, Scheuring S. Force-induced conformational changes in PIEZO1. Nature. 2019;573(7773):230-+.
8.Wang L, Sigworth FJ. Structure of the BK potassium channel in a lipid membrane from electron cryomicroscopy. Nature. 2009;461(7261):292-5.
9.Yao X, Fan X, Yan N. Cryo-EM analysis of a membrane protein embedded in the liposome. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020;117(31):18497-503.
10.Lewis AH, Grandl J. Mechanical sensitivity of Piezo1 ion channels can be tuned by cellular membrane tension. Elife. 2015;4.
關鍵詞：
