北京時(shí)間2022年4月6日，《自然》雜志在線刊登了肖百龍與李雪明團(tuán)隊(duì)合作完成的題為“PIEZO1在脂膜中的結(jié)構(gòu)形變與曲率感知”的論文。
該研究首次解析了機(jī)械力受體PIEZO1在脂膜環(huán)境中的受力形變過(guò)程，定量了其皮牛尺度的機(jī)械敏感性，建立了其曲率感知理論學(xué)說(shuō)，從根本上解答了其將物理機(jī)械刺激轉(zhuǎn)化成生物電信號(hào)這一核心科學(xué)問(wèn)題。
PIEZO諾獎(jiǎng)研究的未解之謎：如何感受機(jī)械力？
機(jī)械力感知決定我們的日常行為，例如握手、擁抱、親吻、行走、刷手機(jī)、血壓飆升等。力是無(wú)形的，那我們?nèi)梭w如何感知？直到2010年，Ardem Patapoutian教授團(tuán)隊(duì)報(bào)道了一類介導(dǎo)人體機(jī)械力感知的分子受體—PIEZO蛋白，為我們認(rèn)識(shí)了解這一基本的生物學(xué)問(wèn)題帶來(lái)了突破。因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)PIEZO并證明其觸覺(jué)受體的功能，Ardem Patapition與David Julius教授(溫度受體發(fā)現(xiàn)者)分享了2021年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)（圖1）。
圖1?2021諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)委員會(huì)發(fā)布的示意圖總結(jié)了PIEZO的發(fā)現(xiàn)（上半部分）、所介導(dǎo)的觸覺(jué)、本體覺(jué)感知等生理病理功能（下半部分右側(cè)）、以及結(jié)構(gòu)模型與機(jī)械力感知假說(shuō)猜想（下半部分左側(cè)）
那么PIEZO蛋白又是如何將物理機(jī)械刺激轉(zhuǎn)化成生物電信號(hào)的呢？肖百龍及其團(tuán)隊(duì)近10年致力于解答這一核心科學(xué)問(wèn)題。其于2012年在Patapoutian課題組從事博士后研究期間首次證實(shí)了PIEZO蛋白是在哺乳動(dòng)物中鑒定發(fā)現(xiàn)的首類機(jī)械門控陽(yáng)離子通道（Nature 2012）；隨后其課題組與合作者在PIEZO的結(jié)構(gòu)功能機(jī)制研究方面取得了一系列重要研究進(jìn)展，幫助推動(dòng)了PIEZO的發(fā)現(xiàn)與研究成為了2021年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)研究成果（圖2）。
圖2?PIEZO的機(jī)械力感知分子機(jī)制研究進(jìn)展總結(jié)基于肖百龍與李雪明課題組合作解析的PIEZO家族成員PIEZO1(1)與PIEZO2(2)的三維結(jié)構(gòu)[MacKinnon(3)以及Patapoutian & Ward(4)課題組也同時(shí)報(bào)導(dǎo)了PIEZO1的結(jié)構(gòu)]以及機(jī)制研究(5, 6)，研究者們提出了PIEZO的機(jī)械力感知機(jī)制猜想：PIEZO形成三聚體三葉螺旋槳狀離子通道，中心是負(fù)責(zé)離子通透的孔道部分，外周是三個(gè)負(fù)責(zé)機(jī)械力感知的槳葉部分（圖1及圖3左側(cè)）。非常有趣的是，在孔道處于關(guān)閉態(tài)，嵌在細(xì)胞膜中的槳葉呈現(xiàn)往細(xì)胞外高度彎曲的狀態(tài)，提示其可以彎曲其所在的細(xì)胞膜，形成我們稱之為納米碗（nanobowl）狀的PIEZO-脂膜體系（圖1及圖3右側(cè)）。有研究顯示PIEZO1蛋白可以在受力刺激下發(fā)生可逆的形變(7)。基于這些結(jié)構(gòu)功能研究，研究者們提出當(dāng)細(xì)胞膜張力改變時(shí)，PIEZO可以從彎曲狀變?yōu)槠秸範(fàn)睿瑤?dòng)中間的孔道開放，從而將機(jī)械力刺激轉(zhuǎn)化為陽(yáng)離子流通。
圖3?PIEZO通道的三聚體三葉螺旋槳狀（左側(cè)部分，俯視圖）與納米碗狀（右側(cè)部分，平視圖）三維結(jié)構(gòu)但事實(shí)上，在2021年諾獎(jiǎng)?lì)C布時(shí)，研究者們還未能解析出PIEZO受力開放的結(jié)構(gòu)。膜上PIEZO在受力后是否會(huì)如諾獎(jiǎng)示意圖中所展示的一樣（圖1），從彎曲的關(guān)閉態(tài)進(jìn)入平展的開放態(tài)？這是PIEZO諾獎(jiǎng)研究的未解之謎。
挑戰(zhàn)與突破：如何引入力？
得益于冷凍電鏡在生物大分子結(jié)構(gòu)解析方面的技術(shù)突破，研究者們可以解析出蛋白在靜息、游離狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)。但是，生物大分子并不是靠“呆若木雞”的狀態(tài)來(lái)發(fā)揮功能，其千姿百態(tài)的變化才是生命奧妙所在，而這些變化往往取決于其組裝形式、配體結(jié)合和所處的物理狀態(tài)（膜環(huán)境、電勢(shì)能、溫度和力等）。如何在嚴(yán)苛的冷凍樣品狀態(tài)下，引入無(wú)形的膜張力來(lái)獲取PIEZO的不同結(jié)構(gòu)功能狀態(tài)呢？
肖百龍與李雪明指導(dǎo)四位博士生楊旭中、林超、陳旭東、李首卿對(duì)這一極具挑戰(zhàn)的科學(xué)問(wèn)題開展研究，借鑒前人把膜蛋白重組進(jìn)脂質(zhì)體中，并用冷凍電鏡解析其結(jié)構(gòu)的技術(shù)(8, 9)，經(jīng)過(guò)反復(fù)嘗試、摸索，最終首次建立了膜上受力結(jié)構(gòu)解析體系(圖4)。該策略的核心是通過(guò)蛋白與脂質(zhì)體之間的曲率差異（curvature mismatch）來(lái)引入膜張力，這對(duì)PIEZO蛋白尤為適用，因?yàn)镻IEZO的114個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域形成的跨膜區(qū)并不在一個(gè)平面上，而是形成納米碗狀的凹陷結(jié)構(gòu)(圖3)。
圖4?PIEZO1-脂質(zhì)體冷凍電鏡三維結(jié)構(gòu)解析PIEZO1的形變與曲率感知特性
PIEZO1本身的曲率半徑接近10 nm，其主要以outside-in的方式重組到脂質(zhì)體中。在同等大小的脂質(zhì)體中時(shí)，曲率相符呈圓形。當(dāng)它重組進(jìn)更大的脂質(zhì)體中時(shí)，曲率半徑的差異在兩者間產(chǎn)生力，蛋白和膜發(fā)生形變，呈水滴狀（圖4c）。
而當(dāng)一小部分PIEZO1以outside-out的方式重組到脂質(zhì)體中（圖4b箭頭所示），PIEZO1蛋白與脂質(zhì)體的曲率半徑朝向截然相反，膜與蛋白間產(chǎn)生的的作用力變大，導(dǎo)致PIEZO1蛋白處于受力展平的構(gòu)象狀態(tài)（圖4d）。
研究者們最終得到PIEZO1在膜上契合狀態(tài)（10 nm曲率半徑）和受力展平的兩種結(jié)構(gòu)，分別命名為彎曲（Curved）和平展（Flattened）構(gòu)象，佐證了PIEZO1蛋白具備可逆形變和感知脂膜曲率變化的特殊能力（圖5）。
圖5?PIEZO1的彎曲（左側(cè)）和平展?fàn)睿ㄓ覀?cè)）三維結(jié)構(gòu)視頻：Piezo在膜上契合結(jié)構(gòu)
視頻：Piezo在膜上受力展平結(jié)構(gòu)
PIEZO1的機(jī)械力感知分子機(jī)制
通過(guò)比較PIEZO1在脂膜上彎曲和平展的兩種結(jié)構(gòu)，研究者們對(duì)PIEZO1感受膜張力后的動(dòng)態(tài)構(gòu)象變化、形變參數(shù)進(jìn)行了定量分析，不僅驗(yàn)證了之前所提出的作用機(jī)制假說(shuō)，并定量了PIEZO1的皮牛尺度的機(jī)械敏感性，進(jìn)而建立了其曲率感知理論學(xué)說(shuō)(圖6)。
圖6?PIEZO1-liposome從彎曲狀到平展?fàn)畹男巫儏?shù)測(cè)量以及機(jī)械敏感性計(jì)算1. PIEZO1的受力形變：Piezo1在受力展平過(guò)程中，其末端有10 nm的向下位移、所占膜面積擴(kuò)張了300 nm2（圖6a, b）。
2. 力的感知機(jī)制—曲率形變特性：Scheuring與Mackinnon團(tuán)隊(duì)合作通過(guò)原子力顯微鏡測(cè)得PIEZO1下壓距離和所需力之間存在線性彈性關(guān)系y=7x+22(7)。引用該公式與自由能變化公式（圖6c），10 nm的位移可得出PIEZO1彎曲和平展?fàn)顟B(tài)之間存在570 pN.nm的能量壘。而Nanobowl儲(chǔ)存了高達(dá)300 nm2的膜面積，意味著只需1.9 pN/nm的張力就能實(shí)現(xiàn)570 pN.nm做功，這與電生理測(cè)量值1.4 pN/nm接近(10)。
3. 力的傳導(dǎo)機(jī)制—納米杠桿原理：力從外周傳遞到中央孔道區(qū)。在展平過(guò)程中，胞內(nèi)Beam長(zhǎng)桿在接近中心孔道模塊區(qū)形成kink，符合之前提出的該位點(diǎn)承擔(dān)支點(diǎn)的功能推測(cè)（圖7）。基于省力杠桿原理，Beam不僅具有力的傳遞與放大功能，且具有形變緩沖作用，使長(zhǎng)臂末端3 nm的形變縮小到短臂端1 nm的形變，使其既能控制中央孔道區(qū)的門控，又不導(dǎo)致其過(guò)度的擴(kuò)張，從而維持PIEZO通道的陽(yáng)離子選擇性通透能力。
圖7?PIEZO1的納米杠桿傳遞機(jī)制4. 力的門控機(jī)制—帽子運(yùn)動(dòng)，跨膜疏水門打開：PIEZO1受力展平時(shí)，使得胞外帽子與槳葉之間的相互作用被打破，帽子發(fā)生順時(shí)針旋轉(zhuǎn)，下方的跨膜孔道區(qū)發(fā)生擴(kuò)張。與PIEZO2（灰色）緊閉的跨膜區(qū)疏水門相比，PIEZO1展平狀態(tài)的結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)10埃的擴(kuò)張（圖8）。?
圖8?PIEZO1的帽子-跨膜疏水門孔機(jī)制綜上，研究者們總結(jié)出PIEZO通道的受力形變與門控機(jī)制（圖9）。
1. 在靜息狀態(tài)時(shí)，PIEZO1使脂膜發(fā)生彎曲，形成碗表面積為628nm2、投影面積為314nm2的納米碗系統(tǒng)，PIEZO1與脂膜處于平衡。
2. 膜張力改變時(shí)，平衡被打破，膜帶動(dòng)著PIEZO1蛋白一起展平。
3. 展平的槳葉帶動(dòng)胞內(nèi)側(cè)的Beam發(fā)生杠桿運(yùn)動(dòng)，把形變傳遞到孔道區(qū)胞內(nèi)側(cè)，可能通過(guò)門閂-拴鎖機(jī)制，打開三個(gè)側(cè)向出口閘門（Lateral plug gate），讓離子流入細(xì)胞 。
4. 展平的槳葉使其與帽子之間的相互作用被打破，帽子的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，加上槳葉的展平運(yùn)動(dòng)，共同使得孔道區(qū)上半段的疏水閥門打開，離子則由帽子下的空隙，側(cè)向進(jìn)入孔道。
圖9?PIEZO1的受力形變與門控機(jī)制模式圖視頻：Piezo彎曲和受力展平的結(jié)構(gòu)比較
總結(jié)而言，本研究首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)機(jī)械力受體PIEZO1通道在脂膜上受力狀態(tài)下的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)解析，揭示了其受力形變與脂膜曲率感知的特性，定量了其皮牛尺度的機(jī)械敏感性，建立了其曲率感知理論學(xué)說(shuō)，從根本上解答了其將物理機(jī)械刺激轉(zhuǎn)化成生物電信號(hào)這一PIEZO諾獎(jiǎng)研究的未解之謎。無(wú)形的力在物理上可被定義為受力對(duì)象的形變。而PIEZO正是利用其納米尺度的曲率形變?nèi)ヌ綔y(cè)皮牛尺度的力，從而成為一類低能耗的超敏機(jī)械力感受器，不由讓研究者們驚嘆生命過(guò)程與物理原理的交匯之美！
肖百龍教授、李雪明研究員為本論文的共同通訊作者，博士研究生楊旭中、林超、陳旭東、李首卿為共同第一作者。
該研究得到了國(guó)家科技部“2030科技創(chuàng)新-腦計(jì)劃與類腦計(jì)劃”重大研究項(xiàng)目、國(guó)家自然科學(xué)基金委杰青項(xiàng)目以及重點(diǎn)項(xiàng)目、清華－北大生命科學(xué)聯(lián)合中心、膜生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、高精尖結(jié)構(gòu)生物學(xué)中心、生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心的項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)支持。
感謝清華大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)和蛋白質(zhì)制備與鑒定平臺(tái)；王宏偉教授團(tuán)隊(duì)劉楠、徐潔提供石墨烯載網(wǎng)；閆創(chuàng)業(yè)研究員團(tuán)隊(duì)分享deep-2D腳本；張馨予、趙天放開發(fā)EPicker軟件；以及王莉、周珩、姚霞、范瀟、雷建林、李曉敏博士給予技術(shù)上的幫助。
肖百龍博士，清華大學(xué)藥學(xué)院長(zhǎng)聘教授，博士生導(dǎo)師。近年來(lái)致力于探究哺乳動(dòng)物包括人類自身如何感知機(jī)械力這一生命科學(xué)本質(zhì)問(wèn)題，合作確立了PIEZO是哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的首類機(jī)械門控陽(yáng)離子通道，進(jìn)而聚焦解答PIEZO通道如何將機(jī)械力刺激轉(zhuǎn)化為電化學(xué)信號(hào)這一關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題，并致力于開發(fā)相關(guān)的新型藥物和生物技術(shù)，迄今取得了系列重要研究成果。
肖百龍實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期招聘對(duì)機(jī)械力感知的分子與神經(jīng)機(jī)制研究以及藥物發(fā)現(xiàn)感興趣的博士后與科研人員，有意向者請(qǐng)郵件聯(lián)系：xbailong@mail.tsinghua.edu.cn。
李雪明博士，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院長(zhǎng)聘副教授。2009年在中科院物理研究所凝聚態(tài)物理專業(yè)取得博士學(xué)位后，赴美國(guó)加州大學(xué)舊金山分校從事冷凍電子顯微學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的博士后研究。李雪明長(zhǎng)期從事冷凍電子顯微學(xué)方法和技術(shù)的研究，以及相關(guān)的生物學(xué)應(yīng)用研究。
相關(guān)論文信息：
https://www.nature.com/articles/s41586-022-04574-8
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